Hs578Bst细胞是人乳腺成纤维细胞系，常用于肿瘤微环境、细胞间相互作用等研究。该细胞为贴壁生长型，培养过程中需注意传代时机、消化时间、培养基选择等关键环节，以确保细胞状态稳定和实验可重复性。以下是Hs578Bst细胞培养的核心操作事项。
一、基本培养条件与培养基配制
1.培养基选择：Hs578Bst细胞常规使用DMEM高糖培养基（含4.5g/L葡萄糖），添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗。血清批次需提前测试，选择支持细胞良好生长的批次。培养基需4℃避光保存，使用前预热至37℃。
2.培养环境：37℃、5% CO₂、饱和湿度的恒温培养箱。CO₂浓度需定期校准，确保稳定。培养瓶/皿需拧松瓶盖或使用透气盖，保证气体交换。
3.细胞形态特征：正常Hs578Bst细胞呈长梭形、成纤维样，贴壁生长，汇合度达80%-90%时需传代。细胞状态不佳时可能出现形态变圆、颗粒增多、脱落等现象。
二、传代操作关键步骤
1.传代时机判断：细胞汇合度达80%-90%时进行传代，避免过度生长导致接触抑制或状态下降。通常每2-3天传代一次，具体间隔需根据细胞生长速度调整。
2.消化液选择与配制：推荐使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（含0.02% EDTA）。消化液需37℃预热，使用前用PBS清洗细胞2-3次，去除血清抑制物。
3.消化时间控制：加入适量消化液，37℃孵育1-2分钟。显微镜下观察，当细胞间隙增大、边缘变圆但尚未脱落时，立即加入含血清的全部培养基终止消化。消化时间过长会导致细胞损伤，影响存活率。
4.吹打与计数：轻柔吹打细胞层，使细胞全部脱落。离心（1000rpm，5分钟）后重悬，进行细胞计数。
5.注意事项：消化过程中避免剧烈晃动培养瓶，防止机械损伤。重悬时动作轻柔，避免反复吹打。传代后24小时内避免频繁移动培养瓶，利于细胞贴壁。
三、冻存与复苏操作要点
1.冻存液配制：使用细胞冻存液，现配现用。DMSO终浓度不超过10%，浓度过高对细胞有毒性。
2.冻存步骤：取对数生长期细胞，消化、离心后，用冻存液重悬至5×10⁶至1×10⁷ cells/mL。分装至冻存管，标记清晰。采用程序降温法：4℃30分钟→-20℃2小时→-80℃过夜→液氮长期保存。或使用细胞冻存盒，直接放入-80℃过夜后转入液氮。
3.复苏操作：从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴，轻轻晃动至全部融化（约1分钟）。用75%酒精擦拭管口，转移至含5mL预温培养基的离心管中，离心（1000rpm，5分钟）去除DMSO。重悬后接种至培养瓶，加入适量培养基。复苏后24小时更换新鲜培养基，去除死细胞。
4.关键点：冻存和复苏过程需快速操作，避免反复冻融。复苏后细胞贴壁可能较慢，需耐心等待。建议每批次冻存多管，并保留复苏记录。
四、质量控制与常见问题处理
1.支原体检测：每1-2个月进行一次支原体检测，确保细胞无污染。一旦发现污染，立即丢弃，并对培养箱、操作台进行消毒。
2.细胞鉴定：定期进行STR鉴定，确认细胞身份，避免交叉污染或误认。
3.常见问题处理：
①细胞生长缓慢：检查血清质量、培养基pH、CO₂浓度；考虑降低传代比例或增加接种密度；
②细胞不贴壁：检查消化是否过度、血清批次是否合适；复苏后延长贴壁时间；
③污染处理：发现细菌、真菌污染立即丢弃，并对环境消毒；支原体污染建议直接丢弃细胞。
五、实验应用注意事项
1.实验前准备：实验前24小时更换新鲜培养基，确保细胞处于良好状态。如需血清饥饿处理，可用无血清培养基培养12-24小时。
2.传代代次控制：建议使用低代次细胞，避免因长期传代导致细胞特性改变。建立细胞库时，冻存低代次细胞备用。
3.操作规范：所有操作需在超净工作台内进行，严格无菌操作。定期检测培养箱、水浴锅等设备，确保环境稳定。
六、总结
Hs578Bst细胞培养的关键在于掌握传代时机、消化时间、冻存复苏等核心环节。规范操作、定期质控、及时记录，是确保细胞状态稳定、实验结果可靠的基础。建议建立标准操作程序（SOP），并对新操作人员进行系统培训，减少人为误差。
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