SH30070.03

TUNEL细胞凋亡检测 (TUNEL Apoptosis Assay)是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。

基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，zui后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。

技术步骤

1. 材料与试剂 (以Promega试剂盒为例)，包括：

(1)生物素标记的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/µL

(2)TdT酶（25U/μL）

(3)反应缓冲液

(4)洗涤缓冲液

(5)异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5µg/mL）或抗地高辛抗体（1︰30）

(6)PI染液（含PI 5µg/mL及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）

(7)PBS缓冲液

(8)塑料盖玻片

2. 样品

(1)悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

(2)贴壁生长的培养细胞

(3)冰冻切片

(4)常规石蜡切片

3. 操作方法

(1)固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

(2)洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min，三次。

(3)反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加反应液（每50μL反应液含TdT酶0.5μL,标记的-dUTP 1μL），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。

(4)终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。

(5)FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/mL），室温下避光孵育10min。

(6)洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

(7)PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。

(8)封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

4. 结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。

应用领域

细胞凋亡(apoptosis)的分析方法，细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生。

服务周期

交货时间： 15~20天

客户须知（对材料的要求、注意事项）

结果提供： 正常和阳性对照玻片及其1张数码照片，剩余石蜡块，检测报告；

样本要求：取材保持组织新鲜（组织块以小于2cm×1.5cm×0.3cm为宜），立即放入固定液（固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲液，体积为组织块的10倍以上）中，避免干燥；对于有血迹的样本，可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中；经固定后的样本必须在48小时内处理。

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