Sv30087.01

TUNEL细胞凋亡检测 (TUNEL Apoptosis Assay)是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。

基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，zui后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。

技术步骤

1. 材料与试剂 (以Promega试剂盒为例)，包括：

(1)生物素标记的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/µL

(2)TdT酶（25U/μL）

(3)反应缓冲液

(4)洗涤缓冲液

(5)异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5µg/mL）或抗地高辛抗体（1︰30）

(6)PI染液（含PI 5µg/mL及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）

(7)PBS缓冲液

(8)塑料盖玻片

2. 样品

(1)悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

(2)贴壁生长的培养细胞

(3)冰冻切片

(4)常规石蜡切片

3. 操作方法

(1)固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

(2)洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min，三次。

(3)反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加反应液（每50μL反应液含TdT酶0.5μL,标记的-dUTP 1μL），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。

(4)终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。

(5)FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/mL），室温下避光孵育10min。

(6)洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

(7)PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。

(8)封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

4. 结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。

应用领域

细胞凋亡(apoptosis)的分析方法，细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生。

服务周期

交货时间： 15~20天

客户须知（对材料的要求、注意事项）

结果提供： 正常和阳性对照玻片及其1张数码照片，剩余石蜡块，检测报告；

样本要求：取材保持组织新鲜（组织块以小于2cm×1.5cm×0.3cm为宜），立即放入固定液（固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲液，体积为组织块的10倍以上）中，避免干燥；对于有血迹的样本，可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中；经固定后的样本必须在48小时内处理。

血清是一种成分复杂的混合物，不同批次血清对细胞生长的促进作用不同。大规模细胞培养中由血清引起的细胞生长状态不佳及病毒滴度的影响表现在以下几个方面：

1、细胞生长速度缓慢，长满单层时间长；从同一细胞瓶中分出两瓶细胞，用同一种培养液，分别加入10％的对照血清和待检血清，在相同条件下培养72小时，会出现对照血清长满单层，而待检血清大约只有60～70％，这种血清就不适合用来大规模培养细胞。

2、细胞传代后形态不正常，细胞状态发生变化 ；由于血清的质量问题，使原本状态正常的细胞经传代后形态会变差；比如：细胞瓶里会出现一些蠕动的小黑点（并非污染），或者细胞表面形成一层油状覆盖物；细胞的轮廓变得模糊，细胞之间的间隙被血清中的蛋白颗粒填充，从而影响细胞向四周扩展生长。

3、细胞传几代后就出现脱壁现象，不能连续传代 ；质量较差的血清缺乏某种细胞的贴壁因子，会使细胞在传代过程中逐渐丧失贴壁的能力。细胞会从正常的贴壁状态，边缘开始萎缩，上翘。观察到的现象就是细胞表面不光滑，晃动细胞瓶会看到细胞表面有絮状物随培养液波动。随着传代次数增加，细胞萎缩的情况越来越严重，直到zui终*脱壁而死亡。

4、细胞长的很好，致密的单层，状态也很正常，但是接毒后细胞基本不发生病变，做滴度检测几乎测不出抗原滴度。这种情况也许是因为血清中含有与接种的病毒有同源的特异性抗体。比如血清中经常会存在乙脑抗体，牛腹泻病毒抗体等，如果存在这些抗体，就会把接进去的病毒给中和掉。如果抗体滴度很高，病毒会被抗体*中和，就没有病毒颗粒在细胞中增殖，所以会检测不到病毒滴度。这种情况给疫苗企业造成的损失是相当大的，不产毒等于前面所做的那么多工作全部白费，浪费人力、物力，尤其是时间上的浪费，从培养细胞开始到接病毒，到收液至少需要一两个月，一旦出现不产毒的情况，那么这一两月时间就白白浪费掉了，这也是牛血清给疫苗企业造成的风险之一。

5、细胞生长的状态一般，产毒少，毒价低。这种情况比较常见，细胞是病毒的载体，由于血清质量不好，导致细胞生长状态不好，病毒就无法进行正常的复制。并非所有病毒都不能复制，所以就造成疫苗的效价不够，可能造成不合格产品。

看来一款血清直接关系细胞的生死存亡，不用担心，慧颖提供无支原体，低内毒素和低血红素的，无反复冻融的高品质血清

慧颖生物专业血清10年，我们不生产血清，我们只是高品质动物血清的搬运工

咨询Hyclone血清货号，Hyclone胎牛血清价格，Hyclone高品质血清，尽在慧颖生物

产品名称    货号    来源    规格    市场价格

胎牛血清FBS Sv30087.01  SOUTH AMERICA   100ML   800

胎牛血清FBS Sv30087.02  SOUTH AMERICA   500ML   1800

优等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

优等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

优等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

特级胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特级胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特级胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特级胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特级胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

特级胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

标准胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

标准胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

活性炭/葡聚糖处理胎牛血清Charcoal Stripped FBS  SH30068.03  USA 500ML   6000

活性炭/葡聚糖处理胎牛血清，热灭活，Charcoal Stripped FBS    SH30068.03HI    USA 500ML   6000

新生牛血清New born calf serum   SH30406.01  New Zealand 500ML   1300

马血清Horse Serum   SH30074.03  USA 500ML   980