293T细胞培养操作流程

293T细胞培养操作流程

1 目的 293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞，因此做好293T细胞的培养，为保证相关实验的正常进行提供必要条件。

2 适用范围 本部门293T细胞培养

3 操作方法

3.1 将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm²新的细胞培养瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的标准操作规程，将生物安全柜的紫外开启半小时。

3.2 将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。

3.2.1 将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO₂培养箱中取出，先用75%的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，用无菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤一次，吸净PBS。

3.2.2 将含EDTA-0.25%tyption用PBS稀释两陪到五倍，向该75cm²的细胞瓶中加入3ml稀释好的EDTA-0.25%tyption，让其充分平铺于细胞表面。盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎牛血清的DMEM终止反应，用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，将细胞液移到15ml无菌的离心管中，1000rpm离心3分钟。

3.2.3 将离心上清吸弃掉，用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进行。

3.2.4 计数好之后细胞传代密度按照2~5×10⁴个细胞/cm²进行传代培养，每个75cm²的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO₂培养箱中培养。

3.2.5 24小时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。