检测口蹄疫血清抗体的方法

检测口蹄疫血清抗体的方法

   （一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）

    该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

 该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1． 试验材料    V型96孔110^。医用血凝滴定板 、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升 刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径1.5毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

 2．试验方法 根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

1. 疫苗接种动物抗体水平监测方法

 接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

    ①稀释待检血清  在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升 丢弃，保持每孔50微升的剂量。此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清  取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清  取中试管5支，第1管加稀释液3.1毫升，第2~5管分别加稀释液0.5毫升，取阳性血清0.1毫升 加入第1管混匀后从中取出0.5毫升，加入第2管混匀后从中取出0.5毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。 

   ④滴加对照孔  取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。

    ⑤滴加正向血凝诊断液   取正向血凝诊断液充分摇匀（瓶底应无血球沉淀），每孔各加25微升后立即置微量振荡器上振荡1分钟，取下血凝板放在白纸上观察每孔中的血球是否均匀（孔底应无血球沉淀）。如仍有部分孔底出现血球沉积，应继续振荡直至*混匀为止。

⑥静置   将血凝板放在室温下（15~30℃）静置2h后判定检测结果，若结果不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。

   ⑦判定标准   先观察10~12孔（对照孔），第10孔为阴性血清对照，应无红细胞凝集现象，红细胞全部沉入孔底，形成小园点或仅有25%红细胞有凝集（“+"的凝集）；第11孔为阳性血清对照，应出现“++"以上的凝集（50%以上的红细胞发生凝集），证明该批正向诊断液的效价达到1：512为合格；第12孔为稀释液对照，红细胞也应全部沉入孔底或只有“+"的凝集。

    在上述对照合格的前提下，观察待检血清各孔，以出现“++"凝集的待检血清zui大稀释度为其抗体效价。例如检测接种口蹄疫O型灭活疫苗的猪群免疫水平时，某份血清1-7孔出现“++"或“++"以上（+++~#）凝集而第8孔仅有“+"凝集，判定该份血清中的O型抗体效价为1：128。

    经实验室测定，口蹄疫O型灭活疫苗的免疫猪群血清中O型抗体效价达到1：128及其以上时，猪群可耐受20个O型强毒发病量的人工感染。

   （2）用于鉴别诊断的正向间接血凝试验

①稀释待检血清  取中试管8支列于试管架上，第1管加稀释液1.5毫升，第2~8管各加稀释液0.5毫升，取待检血清0.5毫升 加入第1管混匀后从中取出0.5毫升加入第2管……直至第8管，待检血清的稀释度依次为1:4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

②稀释阴性对照血清   取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升 ,即成1：16。

    ③稀释阳性对照血清   取中试管5支，列于管架上，每管加稀释液4.9毫升阳血，依次用记号笔标明O、A、C、Asia型和SVD阳血，分别取这5种阳性血清10微升加入相应的试管中（注意每加一种阳性血清，必须单独使用一根吸管），盖上橡胶塞充分摇匀，阳性血清的稀释度即成1：500。

    ④滴加待检血清和对照血清  取第8管待检血清加入血凝板上的1~5排第8孔，取7管血清加入1~5排的第7孔，取第6管血清加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔 50微升。取阴性血清（1：16稀释度）加入1~5排的第10孔，每孔50微升。取1：500稀释的阳性血清加入1~5排的第11孔，每孔50微升。取稀释液加入1~5排的第12孔，每孔50微升。

⑤滴加正向间接血凝抗原（正向诊断液） 第1排1~8孔和10~12孔加O型血凝抗原，每孔25微升。第二排1~8孔和10~12孔加A型血凝抗原，每孔25微升。第三排1~8孔和10~12孔加C型血凝抗原，每孔25微升。第四排1~8孔和10~12孔加Asia-1型血凝抗原，每孔25微升。第五排1~8孔和10~12孔加SVD血凝抗原，每孔25微升。加毕抗原后立即将血凝板置于微量振荡器上中速振荡1分钟，使抗体和抗原充分混匀，各孔不应有红细胞沉淀。

⑥静置  从振荡器上取下血凝板，放在试验台上，盖上玻板，室温（15~30℃）静置2小时，判定结果，若结果不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。

⑦判定标准  先仔细观察每排的10~12孔，10孔为阴性血清对照，12孔为稀释液对照，这2孔均应无凝集现象，或仅出现“+"的凝集。11孔为口蹄疫4个型和猪水泡病1：500稀释的阳性血清对照，应出现“++" ~ “+++"的凝集，证明所使用的5种血凝抗原试剂合格。

    在对照孔符合上述标准的前提下，观察1~5排的第1~8孔，某排1~8孔，出现“#"~“++"的凝集，其余4排仅在1~3孔出现“++"~“+"的凝集，便可判定该份待检血清为阳性，其型别与所加的血凝抗原的型别相同。例出第1排的1~3孔出现“#"凝集，第4-5孔出现“+++"凝集，第6孔出现“++"凝集，第7孔出现“+"凝集，第8孔无凝集（“—"），判定该份待检血清为口蹄疫O型，表明血清中存在O型抗体其效价为1：128。如果该份血清采自口蹄疫O型疫苗免疫过的动物，就不能判定究竟是自然感染产生的抗体，还是接种过疫苗产生的抗体。因为本法尚不能区分感染性抗体和免疫性抗体。为此，欲使本法用于鉴别诊断，采血时必须要弄清该批动物是否接种过口蹄疫或猪水泡病疫苗。

    ⑧注意事项

A．严重溶血和污染的血清样品不宜检测，以免产生非特异反应。

B．勿用90^o和130^o血凝板，以免误判。

     C．有时会出现“前带"现象，即第1~2孔红细胞沉淀而在第3~4孔又出现凝集，这是由于抗原抗体比例失调所致，不影响结果的判定。

D．血清必须是来自康复动物，至少是发病后10天的血清，否则不易检出。

     注：稀释液配方如下：

      Na₂HPO4·12H₂O  (磷酸氢二钠)      35.8克

      Na₂H₂PO4·2H₂O  （磷酸二氢钠)      1.56克

      NaCl           （氯  化  钠）      8.5克

      NaN₃           （迭  氮  钠）      1.0克

    加双蒸水或去离子水至1 000毫升，15磅高压灭菌20分钟，冷却后取出980毫升加正常兔血清20毫升即成，置4℃冰箱贮存备用。该配方适用于正向间接血凝试验和反向被动血凝试验，也适用于猪瘟间接血凝试验。

正向间接血凝抗原及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研究所口蹄疫综防研究组提供。

   （二）口蹄疫中和试验

病毒或毒素与相应抗体结合后，能使其失去对易感动物的致病力或对细胞的感染力，称为中和试验，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养或鸡胚中进行。

1．细胞中和试验

一般采用固定病毒稀释血清法，该法须在无菌条件下操作，亦须细胞适应毒。

   （1）取两列无菌试管，*列为正常血清对照组，第二列为待检血清中和组。先在二列试管中的第1管加含有0.5%水解乳蛋白的汉克氏液（乳白液）3毫升；第2~6管各加乳白液2毫升。

   （2）取正常血清1毫升加入*列的第1管，取待检血清1毫升加入第二列的第1管，混匀后，以同法对倍稀释，1~6管的正常和待检血清稀释度依次为1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128。

   （3）二列试管中的1~6管分别加入 200TCID₅₀细胞适应毒2毫升 充分摇匀，置37℃水浴中保温60分钟。

   （4）取各稀释度的血清分别接种3瓶长满单层的细胞，倾去旧的细胞营养液，每瓶接种1毫升，置37℃恒温箱内静置培养3天，每日镜检一次并详细记录细胞病变情况。

   （5）细胞培养3天后判定结果，正常血清对照组的细胞应全部出现病变；中和组的血清1：8以上无细胞病变，判为阳性。1：8的血清出现细胞病变则判为阴性，该法特异性强，结果可靠，但要求无菌设备和培养细胞的条件，操作繁琐，基层难以应用。

2．乳鼠中和试验

5~7日龄小白鼠对人工接种口蹄疫病毒易感染，产生特征性症状和规律性死亡。因此利用这一特性进行乳鼠中和试验。操作步骤如下：

（1） 将待检血清用生理盐水或pH7.6的0.1M PBS稀释成1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，分别与等量的10^-3口蹄疫乳鼠适应毒混合，37℃水浴保温60分钟。

（2） 每次试验应设阴性血清（1：8）与10^-3病毒的混合液作为病毒对照；已知阳性血清与10^-3病毒的混合液作为阳性对照，处理方法同（1）步骤。

（3） 每一稀释度血清中和组分别于颈背皮下接种5~7日龄乳鼠4只，对照组接种2只，0.2毫升/只，由母鼠哺乳，观察5天判定结果。

    （4）判定标准  先检查对照鼠，阴性对照鼠应于48小时内病死；阳性对照鼠应健活。待检血清任何一组的乳鼠健活或仅死二只，判定该份血清为阳性。以能保护50%接种乳鼠免遭病毒感染的血清zui大稀释度为乳鼠中和效价。

    该法特异性强，结果可靠，简单易行，基层可采用。但存在需时较长，乳鼠易被母鼠所吃或咬死，敏感性低等缺点。

（三）口蹄疫乳鼠保护试验

    待检血清稀释成1：5，接种乳鼠后12小时或24小时，用10^-3病毒攻毒，同时设阴性血清和已知阳性血清（均为1：5稀释）作为对照。观察5天后判定结果。在阴性和阳性血清对照成立的前提下，待检血清组的乳鼠健活，判定该份血清为阳性，反之，则判为阴性。

该法多用于定性检测，一般不作为定量检测手段。

（四）口蹄疫琼脂扩散试验

抗原抗体在琼脂凝胶中，各以其固有的扩散系数扩散，当二者相遇时，在比例适当处发生结合而形成肉眼可见的沉淀带。

操作步骤如下：

1．称取琼脂糖或琼胶素1 克 ,迭氮钠1克，氯化钠 0.85克加pH7.6的0.01M PBS 100毫升。置沸水中煮熔化或15磅高压10分钟。趁热倾入平皿中，厚度3~4毫米。

2. 琼脂冷却凝固后，用打孔器打成中央一孔周围6孔的梅花形孔；中央孔径4~5毫米，周围孔径3毫米与中央孔的孔距3~4毫米。

3.中央孔加已知型别的浓缩抗原，四周孔加不同稀释度的待检血清和阴性、阳性对照血清（1：2稀释），静置扩散1小时。

4. 移入湿盒内于室温或在37℃温箱内自由扩散3~5天，也可放置于4~6℃冰箱内扩散。

5. 判定标准：出现沉淀线判阳性，反之，则判为阴性。

该法无需特殊仪器，设备通常用于定性检测，但需时间长，敏感性差，漏检率高。

   （五）口蹄疫微量补体结合试验

    1．在U型24孔或96孔微量滴定板上每孔滴入生理盐水100微升。

    2．每孔滴入一份经过56℃灭活30分钟的待检血清25微升。

  3．每板设已知阴性、阳性血清2孔对照（与待检血清试验条件相同）。

  4．每孔滴入口蹄疫标准抗原25微升。

  5．每孔滴入补体工作浓度50微升。振荡30秒，37℃温箱保温40分钟。

  6.每孔加溶血素工作浓度 25微升和2%绵羊红细胞 25微升，振荡30秒于37℃下保温30分钟。

    判定结果，阴性对照血清孔应*溶血；阳性血清对照孔应不溶血为合格。凡*溶血的待检血清判为阴性；凡不溶血的待检血清判为阳性。

 该法特异性强，但敏感性低，适用于定性检测。 

（六）口蹄疫对流免疫电泳

1. 电泳槽内的缓冲液为巴氏妥——巴氏妥钠缓冲液。

2. 1克 琼脂糖加pH7.6的0.1M PBS 100毫升加热熔解后浇灌在5×13厘米玻板上厚度为0.6~0.8毫米，冷却凝固后用打孔器制成二排孔，其距离为3~4毫米，每5对孔为一组，组间距离为10毫米。

3. 每组左边孔，分别加O、A、C、Asua-1型和SVD浓缩抗原，每组右边孔加1：2的待检血清。每次试验应设阴性、阳性血清对照，抗原孔边用湿滤纸搭桥接阴极；血清孔边用湿滤纸搭桥接阳极。电压为80-110V，电流强度为15mA，电泳90分钟后取出凝胶板，并置于湿盒内37℃放置3~4小时判定结果。

4. 先检查对照孔，阴性血清应无沉淀线；阳性血清应出现清晰的沉淀线。凡与标准抗原对应孔的中间形成沉淀线的待检血清判为阳性，其型别与标准抗原的型别相同，反之，则判为阴性。

该法较琼扩灵敏度高，适用于大批血清样品的检测。