人同型半胱氨酸（Hcy）Elisa 试剂盒说明书

人同型半胱氨酸(Hcy)Elisa 试剂盒说明书

本试剂盒仅供研究使用

检测范围：0.8 nmol/ml –50 nmol/ml

zui低检测限：0.2 nmol/ml

特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人Hcy，且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期：6个月

预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中Hcy含量。

说明

1. 试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2. 浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

概述

同型半胱氨酸Hcy又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，不属于组成蛋白质的20种氨基酸，体内不能合成，只能来源于蛋氨酸的分解代谢。Hcy是甲硫氨酸代谢形成的中间产物。，在体内由甲硫氨酸转甲基后生成，有两种途径。再甲基化途径：约有50%Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下，以维生素B12为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成蛋氨酸。转硫途径：另外约50%的Hcy经转硫途径不可逆生成半胱氨酸和α酮丁酸，此过程需维生素B6依赖的胱硫醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶参与。Hcy合成和代谢途径及其相关的酶系统、叶酸、维生素B12和维生素B6的缺乏、MTHFR、甲硫氨酸合成酶(MS)、CBS的缺陷都可引起高同型半胱氨酸血症。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗Hcy抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗Hcy抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的Hcy呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板(Assay plate )：                                 一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）：                                 2瓶(冻干品)。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)：                           1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：         1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）：  1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：              1×120ul/瓶（1：100）。
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：        1×120ul/瓶（1：100）。
8. 底物溶液（TMB Substrate）：                            1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液（Wash Buffer）：  1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液（Stop Solution）：                      1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的试剂和器材

1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof管
5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器

6.    蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存

1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃置夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则：

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算浓度时，稀释了“N"倍，标本的浓度应再乘以“N"。

标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50 nmol/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.2 nmol/ml，3.2 nmol/ml，1.6 nmol/ml，0.8 nmol/ml.，样品稀释液直接作为标准浓度0 nmol/ml，临用前15分钟内配制。

如配制25 nmol/ml l标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 nmol/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

生物素标记抗体的稀释原则：

临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul生物素标记抗体加990ul生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：

临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul辣根过氧化物酶标记亲和素加990ul辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

1. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100ul（取1ul生物素标记抗体加99ul生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
2. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，200ul/每孔，甩干。
3. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100ul，37℃，60分钟。
4. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，200ul/每孔，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
7. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

实验备注

1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

计算

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。