免疫学实验要求

•  体液免疫功能检测

–  抗体制备和检测

–  未知抗原或抗体的体外检测

•  细胞免疫功能检测

–  PBMC的分离、扩增

凝集反应：

定义：颗粒性抗原+相应抗体——可见的凝集团块

分类：直接凝集反应：玻片凝集   定性

                    试管凝集   半定量     定量抗原+系列稀释抗体——不同程度的凝集反应——确定抗体滴度

      间接凝集反应：可溶性抗原+致敏颗粒+相应抗体——可见的凝集团块

注意：

Ø  标记试管

Ø  正确使用滴管

Ø  *混匀

Ø  温度: 56℃

Ø  记录时间

Ø  轻拿试管，观察结果，首先观察对照管

琼脂扩散实验：

定义：可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例下形成沉淀线或沉淀环。

分类：单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散    定量实验

      双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散    定性实验

注意：琼脂板一定平整、光滑 (无气泡).

琼脂不可过厚

孔中液体不可过满

体外抗体形成细胞检测——QHS (Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination )定量溶血的分光光度检测

原理：取SRBC免疫的小鼠脾脏细胞—— +SRBC+Complement —— 溶血——通过分光光度计定量检测

注意：

Ø  新鲜SRBC

Ø  保持脾细胞活性

溶血素的收集和溶血素单位的滴定

原理：抗原与抗体结合，暴露抗体上抗原结合位点——Ag+Ab+C——补体活化——靶细胞裂解

酶联免疫吸附试验（ELISA)

定义：用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。

分类：

Ø  间接法（Indirect ELISA）：

•      将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗

•      检测液相中未知抗体

Ø  双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：

•      将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗

•      检测液相中的可溶性抗原

Ø  竞争法（Competitive ELISA) ：

•      将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体

•      检测液相中的可溶性抗原或抗体

间接法测定溶血素   ——定性检测

注意事项：

•    洗涤*，避免交叉污染。

•    按顺序加样，孔底无气泡。

•    包被和温育在湿盒内进行。

补体结合反应（Complement fixation Test, CFT）

定义：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。

原理：补反中包括两个系统五种成分：

ü  待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。

ü  指示系统：绵羊红细胞和溶血素。

注意事项：

•    绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。

•    各种试剂的吸管不可混用。

细胞免疫功能检测

特异性细胞免疫是由T细胞介导的，因此，细胞免疫检测通常是检查T细胞的数量、功能及其产物如细胞因子等，是了解机体细胞免疫状态的重要手段。

1.外周血单个核细胞的分离

原理：外周血+淋巴细胞分离液离心分层

      淋巴细胞 单核细胞    1.070g/l

      分离液               (1.077±0.002g/l)

粒细胞和红细胞       (1.092g/l)

注意：

•    无菌操作.

•    注意血制品污染.

•    控制操作时间，保持细胞存活.

•    应用水平离心机.

2.E－花环形成实验

人类T淋巴细胞表面CD2分子是绵羊红细胞（SRBC）受体，也称E受体，在一定条件下，SRBC环绕T细胞与之结合，形成花环状，称E花环（E-rosette），形成此种花环的细胞称E花环形成细胞（简称E-RFC）。

3.淋巴细胞转化实验

T细胞在体外培养时，当受到非特异性的有丝分裂原（PHA）刺激后可转化为淋巴母细胞，并进行有丝分裂，转化的淋巴母细胞，在形态上出现了幼稚化，光镜下很容易识别，可通过淋巴细胞转化率反映机体T细胞免疫功能。