牛血清白蛋白的鉴定

            牛血清白蛋白的鉴定

实验目的：

通过牛血清清蛋白的提取与鉴定，掌握盐析、离心、透析、电泳、及呈色反应的原理及应用。

实验原理：

   应用相同浓度硫酸铵反复盐析法，将血清中的清蛋白与其他球蛋白分离，再利用透析法除盐，即可提取清蛋白。再利用电泳技术，即可对牛血清清蛋白进行分离与鉴定。

实验步骤：

1.盐析  取离心管一支加入牛血清待测液2 ml、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液4 ml，边加边摇，然后再2000 r/min离心10 min，将上清液倒入试管中，留供后面实验用。

2.透析  去玻璃纸（15cm*15cm）一张，折成袋形，将前面*次盐析得到的含清蛋白的上清液倒入袋内，用线绳扎紧上口（注意要留有空隙），使透析袋下半部浸入盛有半杯蒸馏水中，对蛋白液进行透析，并用玻璃棒搅拌袋外液体，以缩短透析时间。还应经常换水，并用纳氏试剂检查袋外液体的NH₄⁺，观察颜色变化，直至袋内NH₄⁺透析完毕。将袋内液体倒入试管，既得牛血清清蛋白溶液。

3.电泳 

①.点样 取一条2.5cm*8cm膜条，将无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的无光泽面距一端1.5 cm处作为点样线，将牛血清样品与待测的牛血清清蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。

②.电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极，待平衡5 min后，即可通电。用160伏电压通电60分钟，通电完毕后，用镊子将膜条取出。

③.染色  将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染液中，染2 min取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5 min，直至背景漂净为止，用滤纸吸干薄膜。

4.鉴定  比较样品与待测液中清蛋白在薄膜上的电泳结果，比较位置是否一致。

预期结果：如果醋纤膜上的色带位置一致，则说明提取的清蛋白得到了纯化；若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的色带区域，则说明清蛋白的提取不够纯。

实验仪器：

实验试剂：

附表：

    PBS试剂：用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9% NaCl 溶液。

    pH7.2饱和硫酸铵：用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调到pH7.2。

    漂洗液：95%乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸馏水50 ml。

    氨基黑10B 染色液：氨基黑10B 0.5g,甲醇50 ml,冰醋酸10 ml,蒸馏水40 ml。

巴比妥缓冲液：巴比妥钠12.76g,巴比妥1.66g，用少量蒸馏水加热溶解后，再加水稀释至1000 ml。

纳氏试剂：溶解碘化钾30g于蒸馏水20ml内，再加入碘22.5g振摇使其溶解。于此碘液内加入纯汞30g，用力摇振之，待温度升高时，将烧瓶浸于冷水内，并继续摇匀，直到暗棕碘色转变为淡黄绿色为止。将上层溶液倾出，置于量筒内，并以蒸馏水少许洗涤烧瓶，将洗涤液一并倾入。吸取此配成之溶液1到2滴，加入1%可溶性淀粉溶液1 ml内，以试验有无多余的碘存在，如不显蓝色（即无多余碘存在），可加入碘液（碘化钾3g，碘2.5g溶于蒸馏水10 ml内配成）数滴于配成之溶液内，直至此液加于淀粉溶液内初显蓝色为止；将此液以蒸馏水稀释至200 ml，加10%氢氧化钠溶液975 ml，混合，即成纳氏试剂。试剂新配成呈现混浊，静置数日，待其沉淀，再吸上清液供用。