RPMI 1640细胞培养液的配制

RPMI 1640细胞培养液的配制  

1. 配制培养基使用新制备的三蒸水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。

2. 制备培养基的器皿清洗要干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。

3. 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。

4. 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。 

5. 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。

6. 调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％ NaHCO3 调节pH到7.2。 

7. 过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。

8. 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。临用前将加入小牛血清(10%~20%)。 

【注意事项】  每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。  市售小牛血清使用前都应该灭活（56℃，30min），以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。  由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。试验中加入小牛血清后，培养基的pH可能还会变化，故亦可先加入小牛血清后调pH值。但此种方法过滤较困难，只适于正压过滤。  培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48hr，以检测培养液是否有污染。  每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分（主要为谷氨酰胺）损失，造成实验繁琐或者污染。 

细胞培养基DMEM的配制（初学）  2010.07.02  细胞培养基是由合成培养和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、纤维素、碳水化合物、无机离子和其它辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清（１0%）。

【仪器、材料和试剂】

1．仪器：蠕动泵1套，滤器，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器，pH计。

2．材料：3000mL锥形瓶，250mL或500mL培养液瓶，0.22mm的微孔滤膜。

3．试剂：双蒸水，小牛血清，合成培养基（DMEM），NaHCO3。

【操作步骤】 

1．过滤器的准备和安装

（1）清洗好过滤器，干燥 

（2）将一张0.22mm的微孔滤膜在DDW中浸泡后放入滤器，注意不要有气泡。

（3）用布或报纸包装好，121℃ 30min进行高压蒸汽灭菌处理。

（4）在超净台内安装好过滤装置，准备过滤。

2．合成培养基的配制 DMEM    13.5g NaHCO3     3.7g       HEPES   2.38g DDW溶解  10M的NaOH调pH为7.5   定容1L 

(1)将干粉型培养基DMED溶于300ml的三蒸水中，再用300ml水冲洗包装内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。 

(2)加入NaHCO3 3.7g  HEPES   2.38g。磁力搅拌器搅拌。*溶解即可，不易在空气中搅拌过长时间，大量的CO2融入会影响培养基的pH

（3）正常情况下用10M的NaOH调pH为7.5。

（4）过滤除菌。于超净台中滤器过滤。 

（5）滤前、滤后分别取10ml的培养基于15ml的离心管中，置37℃ 24h，检测是否无菌。 

（6）检测无污染后，2℃－8℃下避光保存。  

（7）使用时加入加抗生素：zui终浓度青霉素为100U/ml，链霉素100μg/ml。一般市售青霉素为80万U/瓶，将其溶解在4ml体积内，每1000ml培养液中加0.5ml，即成zui终浓度为100U/ml。市售链霉素为100万U/瓶，将其溶解5ml体积内，也是每1000ml加0.5ml，使其zui终浓度为100μg/ml。

（8）加入小牛血清  市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。  将血清放入56℃水浴中30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。根据培养基量加入小牛血清，使其终浓度为10%。  每次配液量以使用两周左右的量为宜。一次配液不要太多，一是营养成分有损失，二是容易污染。