A549细胞的培养方法

A549细胞的培养

A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。

一、 [所需溶液]

细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、Mg

NACL                         8.00g；

KCL                          0.20g;

KH₂PO₄                                                 0.20g;

Na₂HPO_{4 .。}12H₂O                 1.15g

加水至 1 000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。

消化液

胰酶-PBS

结晶胰酶                      2.5g;

高压灭菌后的PBS              1000ml

用磁力搅拌器搅拌均匀，使其*溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。

胰酶—EDTA:

结晶胰酶                      0.5g;

EDTA盐溶液                    0.2g

无Ca、Mg PBS                  1 000ml

用磁力搅拌器搅拌均匀，使其*溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。

细胞培养液：RPMI 1640培养液

配制方法：

1. 将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。
2. 加入丙酮酸钠 0.1g，NaHCO₂ 2g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和100U/ML链霉素。(一般市售的青霉素为80 万 U/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；市售的链霉素为100 万 U/瓶，将其溶解于5ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml)。
3. 调整培养液的ＰＨ值，用ＰＨ精密试纸观察　ＰＨ７.２～７.４即可。
4. 过滤法除菌，所使用的滤器为Ｏ_２加压过滤，０.２２μｍ滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。
5. 分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置—20℃保存。

二、［细胞的维持和培养］

• 细胞的复苏

• 准备一个盛有３７℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，放于３７℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。
• 1000～２000 r，3～５min离心。
• 在无菌操作台中采用75%的乙醇*擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。
• 用1ml枪头将上清液去除，加入1ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm²培养瓶中。
• 补充4ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。
• 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO₂培养。
• 24h后，更换新的培养液。
• 常规传代培养。

• A549细胞更换新的培养液

• 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
• 用PBS反复冲洗细胞2～3遍。
• 加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。

各种液体需要量（ml）

• 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO₂培养。

• A549细胞的传代

• 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
• 向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～３遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。
• 加入1ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～８min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。
• 加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。
• 吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm²培养瓶中，补足培养液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为5～10ml。
• 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO₂培养。

注意事项：

• 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应调整PH至7.2左右，均不能超过7.4。
• 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。
• 严格执行无菌操作的要求。
• 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。
• 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。

• A549细胞的冻存

• 消化已生长融合的单层细胞。
• 用生长液悬浮细胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO(二甲基亚砜)。分装在2ml容积的冻存管中。
• 用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70℃冰箱中一夜。
• 放入液氮中冻存。