小鼠_TNF-α_elisa试剂盒说明书

小鼠_TNF-α_elisa试剂盒说明书

本试剂盒仅供研究使用

检测范围：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低检测限：7.8 pg/ml

特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的小鼠TNF-α，且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期：6 个月

预期应用：ELISA 法定量测定小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中TNF-α

含量。

说明

1．试剂盒保存：-20℃(较长时间不用时)；2-8℃(频繁使用时)。

2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任

何影响。

概述

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一种具有多种生物活性的细胞因子。兔子TNF-α

基因编码前体蛋白，其信号肽将前体蛋白固定在细胞膜上，成为具有活性的跨膜干扰素

(TNF)，分子质量为26×103，经酶切去除信号肽生成分泌型TNF-α，分子质量为17×103。

TNF-α细胞来源广泛，包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞、角质细胞、

平滑肌细胞、星形细胞、成骨细胞等。

TNF-α具有广泛的生物学活性，如：参与炎性反应和免疫应答，抗肿瘤，参与内毒素性休

克等病理过程，引起恶病质等。其具有双重作用，,一方面在机体免疫调节，机体生理功能

和抗感染等方面发挥重要作用，另一方面若持续释放或产生过多则会引起发热!、休克、恶

病质等，同时TNF-α可进一步诱导IL-6、IL-8、IL-10 等细胞因子的产生，这些促炎性细胞

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因子参与体内急性反应、发热反应、引起趋化肽释放等，还可使内皮细胞活化而导致血管通

透性增加。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗TNF-α抗体的微孔中依次加入标本或标

准品、生物素化的抗TNF-α抗体、HRP 标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB 显色。

TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅

和样品中的TNF-α呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓

度。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板(Assay plate )：一块(96 孔)。

2. 标准品(Standard)：2 瓶(冻干品)。

3. 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。

5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。

6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody)：1×120ul/瓶(1：100)

7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)：1×120ul/瓶(1：100)

8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。

9. 浓洗涤液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。

10. 终止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的试剂和器材

1. 标准规格酶标仪

2. 高速离心机

3. 电热恒温培养箱

4. 干净的试管和Eppendof 管

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5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器

6. 蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存

1. 血清：全血标本请于室温放置2 小时或4℃一夜后于1000 x g 离心20 分钟，取上清即可

检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 - 8° C 1000 x g 离心15

分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将标本

放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则：

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准

曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算浓度

时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。

标准品的稀释原则：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以上，

然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2000 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释2000

pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，样品稀释液

直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15 分钟内配制。

如配制1000 pg/ml 标准品：取0.5ml(不要少于0.5ml)2000 pg/ml 的上述标准品加入含0.5ml

样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

生物素标记抗体的稀释原则：

临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制

(每孔100ul)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul 生物素标记抗体加990ul 生物素标

记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：

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临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的

总量配制(每孔100ul)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul 辣根过氧化物酶标记亲和

素加990ul 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内

配制。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试

剂盒的检测范围。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标

准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，

轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120 分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100ul(取1ul 生物素标记抗

体加99ul 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60

分钟。

3. 温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分钟，350ul/每孔，甩干。

4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100ul，37℃，60

分钟。

5. 温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分钟，350ul/每孔，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色(30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4 孔

有明显的梯度蓝色，后3-4 孔梯度不明显，即可终止)。

7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与

底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度(OD 值)。在加终止液后15 分钟以内进

行检测。

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注：

1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。

测量时先用此孔调OD 值至零。

3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过

氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生

物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，

酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml 注入孔内，浸泡1-2 分钟。根据需

要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

计算

以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD 值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上

绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准

物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出

样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

3. 一次加样时间控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。

5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

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6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

7. 底物请避光保存。

8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

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