ELISA方法操作步骤详述

操作步骤 

方法一 

用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 

1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 

方法二 

用于检测未知抗体的间接法： 

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 

每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。 

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加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔 中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 

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于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml， 

37℃孵育30-60分钟，洗涤,zui后一遍用DDW洗涤。 

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其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。