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大鼠(Rat)基质细胞衍生因子1a(SDF-1a/CXCL12)ELISA试剂盒说明书(一步法)

发布时间:2013-11-18浏览:938次

 产品优点:在原来两部双抗夹心的稳定性基础上改进,节省生物样本及操作时间。

大鼠(Rat)基质细胞衍生因子1aSDF-1a/CXCL12ELISA试剂盒(一步法)操作说明书

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被大鼠基质细胞衍生因子1aSDF-1a/CXCL12)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠基质细胞衍生因子1aSDF-1a/CXCL12)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.  血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1.酶标仪(450nm

2.高精度加样器及枪头:0.5-10uL2-20uL20-200uL200-1000uL

3.37℃恒温箱

操作注意事项

1.  试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解

2.后再使用。

3.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。

4.  预处理后的样本无需稀释,直接取10μL加样即可。

5.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

6.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称

96孔配置

48孔配置

备注

微孔酶标板

12孔×8

12孔×4

标准品16ng/mL)

0.6mL

0.6mL

按说明书进行稀释

标准品稀释液

6mL

3mL

样本稀释液

6mL

3mL

检测抗体-HRP

5mL

3mL

20×洗涤缓冲液

20mL

20mL

按说明书进行稀释

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

终止液

6mL

3mL

封板膜

2

2

说明书

1

1

自封袋

1

1

注:标准品(S0-S5)浓度依次为:00.51248ng/mL

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按120稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。

2.  自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

操作步骤

3.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

4.  设置标准品孔、样本孔和空白孔,空白孔什么都不加;标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

5.  待测样本孔先加样本稀释液40μL,再加待测样本10μL

6.  随后标准品孔和样本孔中(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50μL,,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min

6.  弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

7.  所有孔加入底物AB50μL37℃避光孵育15min

8.  所有孔加入终止液50μL15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

 绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能

1. 准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900

2.灵敏度:zui低检测浓度小于0.1 ng/mL

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