永生化人口腔黏膜上皮细胞培养方法

永生化人口腔黏膜上皮细胞

该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。

种属：人源（Homo sapiens）

细胞来源：口腔（Oral cavity）

疾病： 正常（Normal）

培养环境 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

完培配置：原代上皮细胞培养体系；推荐使用HAKATA培养基，W-P-500;（联系慧颖市场部）

生长特征： 贴壁生长

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2传代，贴壁部2-3分钟

倍增时间： 每周 2 至 3 次

冻存条件： 冻存液：90%FBS ，DMSO 10%,或使用HAKATA H-W-100;

细胞接收：

1：观察有无破损漏液情况，如有请拍照及时联系客服。

2 ：酒精消毒培养瓶表面后显微镜下观察细胞状态，观察拍照后不用打开培养瓶盖，放入培养箱静止 2

- 3小时稳定细胞状态。

3 ：请按照细胞操作指南进行第一次传代冻存处理。

4 ：产品随货会附带细胞说明书、细胞培养操作指南。

5 ：若产品有异常或其他疑问，可随时联系客服

6.收到后，培养条件(完培配置)需跟保持一致，如有变动销售另行告知

仅限于科学研究，不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用。

操作步骤：

贴壁细胞接收后的处理：

1. 收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-4h，若发现培养瓶破损 、有液溢出及细胞有污染 ，请拍照后及时联系我们

2. 静置完成后，请在显微镜下确认细胞状态 ，同时给刚收到的细胞拍照(10x ，20x)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据 。

3. 贴壁细胞:细胞在379C培养箱中放置2-3h ，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况 。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基 (若有未贴壁的细胞需要离心回收 ，重悬打入到原培养瓶中)加入新配制的培养基6-8mL ，放到细胞培养箱中继续培养 。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理 。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收 。

备注:运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的培养基来培养细胞 。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1:2传代 。

细胞复苏：

贴壁细胞的复苏、传代、冻存步骤：

1. 贴壁细胞复苏:从液氮灌中或-80℃C冰箱中查找到需要复苏的细胞，水浴锅提前打开预热 37℃℃1)将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻;

2.加入到含4-6mLwanquan培养基的离心管中混合均匀。

3.弃去上清液，培养基重悬细胞 。然后将细胞悬液加入含6-8m!培养基接种于T25 培养瓶中(或6cm 皿中) ，培养guo夜，第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度 。

4. 贴壁细胞传代:如果细胞密度达80%-90% ，即可进行传代培养

5.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞 1-2 次;

6.加 1-2mL 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于 37°℃培养箱中消化2-3min，然后在显微镜 下观察细胞消化情况 ，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后 ，加5ml以上含10%血清的wanquan培养基终止消化;3)轻轻吹打细胞，脱落后吸出至离心管中，1000rpm离心3-5min ，弃去上清液，补加1-2mLwanquan培养基后吹匀;4)按 5-6mL/瓶补加wanquan培养基，将细胞悬液按 1:2到 1:3的比例分到新的含 6-8mLwanquan培养基的培养皿中或者培养瓶中 。

7. (传代两个T25或者两个6cm的皿)

贴壁细胞冻存:

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的 冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1x10 6~1x107个活细胞/ml;

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1m(冻存液含1x10^6~1x107个活细 胞/ml分配到-个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称 、代数 、日期等信息;

3. 按冻存数量加入无血清冻存波后直接放-80℃冰箱guo夜 ，后续可转入液氨罐中长期保存 。