人真皮毛乳头细胞永生化

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细胞接收处理流程：

1：观察有无破损漏液情况 ，如有请拍照及时联系客服。

2：酒精消毒培养瓶表面后显微镜下观察细胞状态 ，观察拍照后不用打开培养瓶盖 放入培养箱静止2-3小时稳定 细胞状态。

3：请按照细胞操作指南进行次传代冻存处理。

4：产品随货会附带细胞说明书、细胞培养操作指南、细胞鉴定、支原体检测报告。

5：若产品有异常或其他疑问 ，可随时联系客服；转至技术支持。

细胞接收后的处理

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-4h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）静置完成后，请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10× , 20×) 各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的培养基）。

4）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可

以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收 。

5）半贴细胞和贴壁不牢（悬浮）细胞：T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在60%以下，客户需收集T25瓶中的悬浮细胞离心后用培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长70%-90%对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。

6）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的培养基来培养细胞。    收到细胞后次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

细胞处理：

1. 复苏细胞：从液氮灌中或-80℃冰箱中查找到需要复苏的细胞，水浴锅提前打开预热 37℃。

1) 将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻；

2) 加入到含4-6mL培养基的离心管中混合均匀。

3) 弃去上清液，培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml培养基接种于 T25 培养瓶中（或 6cm 皿中），

培养过夜，第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2. 细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

1) 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次；

2) 加 1-2mL 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化 2-3min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后，加 5ml 以上含 10%血清的培养基终止消化；

3) 轻轻吹打细胞，脱落后吸出至离心管中，1000rpm离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀；

4) 按 5-6mL/瓶补加培养基，将细胞悬液按 1:2 到 1:3 的比例分到新的含 6-8mL培养基的培养皿中或者培养瓶中。

（即 1 个 T25 传代接种至 2~3 个 T25 或者 2~3 个直径为 6cm 的培养皿）

3. 细胞冻存：

1）细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1× 10^6~1×107个活细胞/ml.

2）1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每 1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、 日期等信息。

3） 按冻存数量加入无血清冻存液后直接放-80℃冰箱过夜，后续可转入液氮罐中长期保存。