ELISA不同方法介绍

                               ELISA不同方法介绍

我们知道ELISA方法也包含不同的方法和原理，主要有：双抗夹心法ELISA、双位点一步法ELISA、间接法ELISA、双抗原夹心法ELISA、竞争抑制法ELISA、IgM抗体捕获法ELISA、应用亲和素和生物素ELISA；下面我们就这几种不同ELISA方法，逐一介绍：

一、双抗夹心法

双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，但仅适用于2价或2价以上抗原的检测，而不适用于小分子抗原或半抗原物质的测定。其测定原理是将特异性抗体包被于固相载体上，形成固相抗体；加入含待测抗原的样品，使之与固相抗体结合；再加入酶标记的另一特异性抗体，使酶标抗体与固相免疫复合物中的抗原结合；zui后加入底物显色。溶液颜色的深浅与标本中待测抗原的量成正比。

二、双位点一步法

    双位点一步法是在双抗体夹心法的基础上改进而来的，应用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，在测定时可将标本和酶标抗体同时加入。这种方法的优点是简化了操作，缩短了反应时间，而且由于使用了高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高；缺点是当标本中待测抗原浓度相当高，大大超过了固相抗体的结合能力时，可能出现钩状效应（hook effect），即过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，测得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性。

三、 间接法  

    间接法主要用于检测抗体，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的待测抗体。首先用特异性抗原包被固相载体，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合，再加入酶标记的第2抗体，使之与待测抗体结合；反应后再加入底物显色，颜色的深浅与标本中待测抗体的量成正比。此方法的特点是只需一种酶标记的第2抗体就可以检测多种抗体，因而在临床中广泛用于检测各种感染性疾病的抗体；缺点是易受到标本中多种物质的干扰而产生假阳性反应。

四、 双抗原夹心法  

    双抗原夹心法与间接法的不同是用酶标记的特异性抗原代替酶标记的第2抗体，可以减少假阳性反应。

五、竞争抑制法

    该法可用于检测抗原或抗体，显色的深浅与标本中待测抗原或抗体量成反比。以测定抗原为例，待测样品中的抗原与酶标记抗原竞争与固相抗体结合，待测抗原含量越多，能与固相抗体结合的酶标记抗原就越少，则显色越浅。

六、IgM抗体捕获法

    血清中针对某些抗原的特异性IgM常和非特异性IgM，以及特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM的测定。捕获法则较好地解决了上述问题，其原理是先用抗人IgM（／／链）抗体包被固相载体，使血清中所有IgM（包括特异性与非特异性IgM）均固定在固相上，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。此方法目前主要用于检测各类早期感染的特异性抗体IgM。

七、应用亲和素和生物素方法

    亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取，分子量为60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子紧密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244．31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide ester，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位点，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA耦联起来，就可大大提高其灵敏度。

    亲和素生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且可使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标记抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素与酶的结合物，以放大反应信号。