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YD-38细胞,传代细胞培养
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YD-38细胞,传代细胞培养[实验步骤1]
1、准备工作:1)肥皂洗手,在进行无菌操作前,用75% 的酒精擦拭双手,注意指间,和指甲周围。同时,用酒精棉球擦拭超净台。2)将培养液放置室温,备用。3)打开超净台内的紫外灯,照射20 min。同时,将实验所需材料也放入超净台进行灭菌(血清、培养基除外)4)倒置显微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶。
2、关闭超净台的紫外灯,打开风机。
3、点燃酒精灯,取出刻度吸管,在火焰上略烧,然后,安上吸球待用。
4、在打开培养瓶之前,用酒精棉球擦拭瓶盖,打开后,瓶口在酒精灯上过火焰,再用吸管轻轻吸出旧的培养液,注意,吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。
5、将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察,见到细胞的突起消失,变圆时,立即翻转培养瓶,吸出胰酶。记住不要消化时间过长,否则,细胞会被胰酶消化掉。
6、加入适量Hanks液或培养基清洗一遍,立即倒掉。
7、加入含有10%血清的培养基,用吹打管吹打,一定要轻轻吹打,使其从瓶壁上脱落分散到培养基中,再补加培养基,按1:3进行分瓶。然后,用火焰烧培养瓶的瓶口和盖,再盖好培养瓶的盖,放到培养箱中进行培养。
以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法,对于悬浮细胞的传代培养方法,只需要将细胞进行离心,1000 rpm,5 min,然后,换入新的培养基即可。再分装到不同的培养瓶中进行培养。
不健康的细胞质中有空泡,细胞内有颗粒样物质,细胞间空隙增大,变形,不规则,失去原有的特点。
4. 是否污染:
传代或换液24~ 48 h注意观察细胞是否被污染,污染的细胞培养液变浑浊,镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢,生长特性改变,胞质内颗粒性物质增多,尽管培养液不变浑浊,考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走,以免污染其它细胞。
实验四、细胞冻存与复苏
YD-38细胞,传代细胞培养[实验步骤2]
1. 为了保证细胞良好的状态,在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期,同时将细胞换液,次日,按照细胞传代培养方法,用胰酶消化贴壁细胞,将细胞用培养基冲下来,然后,用50 mL尖底离心管离心,1000 rpm,4min,弃上清,收集细胞。
2. 加入适量的冻存液(10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培养基)
3. 分装到冻存管中,做好标记,标明细胞名称,保存时间,所用培养基等。
4. 4℃放置30 min;-20℃放置1.5 h; -70℃放置12 h;zui后移到液氮罐中。
细胞的复苏:
细胞的复苏原则是快速溶化,因为如果缓慢的溶化,会使进入细胞的水分形成冰晶,对细胞造成伤害,因此,在复苏细胞时,将冻存细胞直接放到37℃的水浴中,使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接倒入小培养瓶或培养皿内,然后,加入3 mL的培养液。次日,观察细胞生长情况,并更换细胞培养液。
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