人乳腺导管癌细胞BT-474【BT-474】细胞株

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细胞来源：人乳腺导管癌细胞

细胞简介：BT-474细胞为人乳腺导管癌细胞，来源于人乳腺导管癌，中文名为人乳腺导管癌细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。

培养基：RPMI-1640 90%, Fetal Bovine Serum 10%

培养条件：37℃ 5% CO2

消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA溶液，消化5-10min

传化比例：1：2-1：3

换液时间：3-4天换液一次

冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO

冻存密度：1-3 ×10^6/管，液氮保存

库存状态：现货

细胞纯度：94％

细胞活力：90％（ViabilitybyTrypanBlueExclusion）

细胞检测：细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌

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注意事项：

高压消毒实验用品：操作台上不是一次性的物品均需做灭菌处理，无法高压的物品应使用75%酒精消毒。

消毒操作间和操作台：使用75%酒精擦拭无菌间的墙面、地面，操作台的台面，孵箱，离心机等。操作前须用紫外线照射无菌间和操作台30分钟消毒。入无菌间须穿隔离服，戴手套、口罩、帽子。用75%酒精洗去手套上的滑石粉。

无菌操作：操作时应尽量接近酒精灯；拿取吸管时，避免接触其使用端；不要在开口器皿的上方操作；吸取不同液体应更换吸管。不能碰瓶口。万一碰到，更换吸管。

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的培养

【初代培养原理】

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：动物组织块

试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

【初代消化培养法】

（1）准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

（2）布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

（3）处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

（4）剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

（5）消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

（6）分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

（7）计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO23调整。

（8）培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

【初代组织块培养法】

《1》剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

《2》摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

《3》轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

《培养》从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

【传代培养法原理】

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

【材料和试剂】

1）细胞：贴壁细胞株

2）试剂：0.25％胰酶、DMEM 90%,德国SERANA胎牛血清 Fetal Bovine Serum 10%

3）仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

【操作步骤】

1）吸除培养瓶内旧培养液。

2）向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3）置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4）吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5）用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6）计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

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注意：换液时一半用我们的培养基，一半用你们的，以免细胞不适应而造成生长不好。