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人C肽(C-Peptide)ELISA试剂盒

  • 产品型号:
  • 产品时间:2017-11-22
  • 简要描述:人C肽(C-Peptide)ELISA试剂盒,用途测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中C-Peptide含量。
    规格:48T/96T。本试剂盒只可用于科研,不得用于其他!
  • 产品简介

人C肽(C-Peptide)ELISA试剂盒                                                        

预期应用

ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中C-Peptide含量。

人C肽(C-Peptide)ELISA试剂盒    

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中C-Peptide水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入C-Peptide抗原、生物素化的抗人C-Peptide抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的C-Peptide呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

  1. 酶联板:一块(96孔)
  2. 标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为20,000 pg/mL,做系列倍比稀释后,分别稀释成20,000 pg/mL, 10,000 pg/mL5,000 pg/mL 2,500 pg/mL1,250 pg/mL625 pg/mL312 pg/mL,其原液直接作为zui高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL,临用前15分钟内配制。

如配制10,000 pg/mL标准品:取0.5ml 20,000 pg/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

  1. 样品稀释液1×20ml/瓶。
  2. 检测稀释液A1×10ml/瓶。
  3. 检测稀释液B1×10ml/瓶。
  4. 检测溶液A1×120ul/瓶(1100)临用前以检测稀释液A 1100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
  5. 检测溶液B1×120ul/瓶(1100)临用前以检测稀释液B1100稀释。稀释方法同检测溶液A
  6. 底物溶液1×10ml/瓶。
  7. 浓洗涤液1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
  8. 终止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

    

标本的采集及保存

1.细胞培养物上清:请离心后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。

2.血清:标本请于室温放置2小时或4℃一夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

3.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

注:标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

    

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,应在试管中将样品用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。

  1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul余孔分别加标准品或待测样品100ul,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37反应120分钟。

为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。

  1. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul(取1ul检测溶液A99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。
  2. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
  3. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul3760分钟。
  4. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
  5. 依序每孔加底物溶液90ul37℃避光显色(30分钟内)(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显)。
  6. 依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
  7. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

    

1 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。

3.  未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用,不要一次用完。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

4.  建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。

 

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水

纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需

要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

 

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的人C-Peptide,且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

  以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

注意事项

  1. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
  2. 一次加样时间控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
  3. 请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。
  4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请zui后乘以稀释倍数。

5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

6.底物请避光保存。

检测范围:

312 pg/mL -20,000 pg/mL

说明

1.试剂盒保存:-20(较长时间不用时);2-8(频繁使用时)。

2.有效期:6个月

3.浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

5.中、英文说明书可能会有不*之处,请以英文说明书为准。

 

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